超高速原子力显微镜HS-AFM+NanoDSF观察TRPV3通道五聚体

HS-AFM结合nanoDSF助力TRPV3通道五聚体结构研究

《Nature》：一种具有扩张孔道的五聚体 TRPV3 通道

A pentameric TRPV3 channel with a dilated pore

206 | Nature | Vol 621 | 7 September 2023

 

Shifra Lansky, John Michael Betancourt, Jingying Zhang, Yining Jiang, Elizabeth D. Kim, Navid Paknejad, Crina M. Nimigean, Peng Yuan & Simon Scheuring

摘要： 目前已经解析了大量的瞬时受体电位通道TRP(transient receptor potential)家族的结构，显示都是四聚体，但关于TRPV通道的许多方面仍然知之甚少，包括孔膨胀现象（pore-dilation phenomenon）。科学家通过超高速原子力显微镜HS-AFM，在单分子水平上分析了膜嵌入的TRPV3，并发现了一种五聚体状态。并且通过NanoDSF进一步探究了 DPBA对TRPV3四聚体状态的破坏作用。

瞬时受体电位（TRP）通道是一个庞大的真核离子通道超家族，控制着多种生理功能，因此是极具吸引力的药物靶点。目前已确定了来自 20 多种不同 TRP 通道的 210 多种结构，且均为四聚体。尽管有如此丰富的结构信息，但关于 TRPV 通道的许多方面仍知之甚少，包括孔道扩张现象，即长时间激活会导致电导增加、对大离子的通透性增强以及整流性丧失。在此，我们利用日本RIBM公司的超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM，SS-NEX）在单分子水平上分析了嵌入膜的 TRPV3，并发现了一种五聚体状态。HS-AFM 动态成像显示，五聚体在与经典四聚体的动态平衡中具有短暂性和可逆性，通过膜扩散亚基交换实现。加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，五聚体的群体增加，DPBA 是一种已被证明可诱导 TRPV3 孔道扩张的激动剂。基于这些发现，我们设计了一条蛋白质生产和数据分析流程，最终获得了 TRPV3 的冷冻电子显微镜结构。五聚体，其孔径比四聚体大。进入和退出五聚体状态的缓慢动力学、加入 DPBA 后五聚体形成的增加以及孔径的扩大表明，五聚体代表了孔径扩张的结构相关性。因此，我们展示了膜扩散原体交换作为结构变化和构象变异性的一种额外机制。总的来说，我们为非典型的五聚体 TRP 通道组装提供了结构证据，为 TRP 通道研究开辟了新的方向。

瞬时受体电位（TRP）通道构成一个庞大的离子通道超家族，广泛表达于脊椎动物、无脊椎动物、酵母和藻类等真核生物中。该类通道可响应多种刺激类型，并参与多样化的生物过程，包括温度感知、伤害性感受和味觉感知等感觉功能，以及体液分泌、离子稳态、溶酶体功能、免疫细胞功能、心脏与平滑肌功能。由于其广泛的表达分布和生理功能，TRP通道的突变会导致多种疾病，如疼痛、特应性皮炎、哮喘、心脏疾病及神经与代谢紊乱。在TRP通道结构与功能研究领域取得的重要进展，始于通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）首次解析的TRPV1通道结构。这一突破标志着冷冻电镜分辨率革命中膜蛋白结构解析的开端。截至目前，已有超过20种不同TRP通道的210余个结构被解析，所有结构均呈现四聚体组装模式（补充数据图1）。

为了解决其中一些未解决的问题，我们在此使用超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM）直接在缓冲溶液中、在生理温度和压力下以约 1 秒的时序分辨率对膜嵌入的全长人 TRPV3 进行单分子水平的成像。我们认为，要深入了解一些遗留问题，采用一种迄今未用于分析 TRP 通道且具有质的不同能力的新技术可能会有所帮助。我们证明了 TRPV3 通道能够形成一种此前未曾观察到的五聚体状态，这种五聚体状态较为罕见、可逆且短暂：五聚体状态与四聚体状态在数秒至数分钟的时间尺度上通过膜扩散交换亚基而相互转换。我们进一步证明，在加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，这种五聚体状态的出现频率增加了一倍，DPBA 是一种合成激动剂，已被证明能增强 TRPV3 电流并导致孔径扩张。基于对这种非典型状态及其形成方式的了解，我们调整了蛋白质生产和分析流程，从而能够以 4.4 埃的分辨率确定 TRPV3 五聚体的冷冻电镜结构，揭示出一个宽大的通道孔，比四聚体中的孔大得多。总体而言，我们的研究结果表明，TRPV3 通道能够形成五聚体状态，这可能是功能上孔径扩张状态的结构对应物，并可能为 TRP 通道研究开辟新的途径。

图 1 | TRPV3 的膜重组。a，TRPV3 单体结构，包括 ARD（紫色）、连接区和前 S1（蓝色）、VSLD（S1–S4，黄色）、PD（S5–SF–S6，粉–绿–粉）、TRP 螺旋（米色）和 CTD（蓝色）。b，序列表示，颜色编码如 a 所示。c，人类 TRPV3 四聚体结构（PDB 6UW4）的细胞内（上）和侧面（下）视图，四个亚基颜色编码。VSLD 相对于 PD 发生了结构交换，例如，紫色亚基的 VSLD 与黄色亚基的 PD 相互作用。d，TRPV3 在酵母极性脂质和 POPC:DOPS：胆固醇（8：1：1，质量比）膜中重组的代表性负染 EM 图像。类似的重组和 EM 图像已重复超过 20 次。比例尺，50 纳米。e，TRPV3 重组的 HS-AFM 视频帧概览。f，e 中虚线轮廓的高度分布分析（左上），根据高度伪彩色标尺着色。g，e 中虚线的横截面分析（右下）。

图 2 | TRPV3 五聚体与经典的 TRPV3 四聚体在膜中共存。a，中分辨率 HS-AFM 视频帧（补充视频 5 - 9）显示膜中的 TRPV3 存在多个具有五聚体寡聚态的通道（箭头所示）。比例尺，15 纳米。b，高分辨率 HS-AFM 视频帧（补充数据视频）显示四聚体和五聚体 TRPV3 通道。比例尺，5 纳米。c，TRPV3 四聚体（绿色）和五聚体（紫色）单分子的径向轮廓（ b）。黑色线分别代表具有 90°和 72°峰周期性的正弦拟合。d，四聚体（绿色）和五聚体（紫色）相关平均值的高度轮廓（来自 b，第二面板），分别沿插图中的绿色和紫色线。e，突起高度分析。TRPV3 四聚体（中间，绿色）和五聚体（右侧，紫色）相对于脂质双层的高度分布直方图。左面板显示了从四聚体、五聚体和脂质双层区域（直径 8.5 纳米）提取高度值的虚线轮廓，从 100，734 个像素（206 帧中的 489 个像素）中提取。FWHM，半峰全宽。

图 3 | TRPV3 四聚体 - 五聚体和五聚体 - 四聚体的转换，以及四聚体和五聚体状态之间完全可逆性的观察。a、b，TRPV3 四聚体 - 五聚体转换的示例。c、d，TRPV3 五聚体 - 四聚体转换的示例。e，TRPV3 四聚体 - 五聚体 - 四聚体转换。f，TRPV3 五聚体 - 四聚体 - 五聚体转换。白色箭头分别指示单体“攻击”并插入四聚体以及从五聚体中解离。g，观察到的转换的数量和类型（灰色区域表示观察窗口）。从上到下：开放式的五聚体状态观察、无始无终的五聚体观察、观察到的五聚体向四聚体的转换以及包含五聚体状态的起始和结束，即完整的四聚体 - 五聚体 - 四聚体转换。h，观察到的五聚体状态向四聚体转换的停留时间（n = 17）。直方图拟合为指数衰减，τ = 192 秒，调整后的 R² = 0.77。i，无始无终的五聚体状态的停留时间（n = 65）。平均停留时间 τ = 172 秒。

为了进一步探究 DPBA 对 TRPV3 四聚体状态的破坏作用，我们进行了纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）实验，并通过监测 350 和/或 330 纳米处荧光发射随温度的变化来测量 TRPV3 的热稳定性。在 nanoDSF 实验中，测量的是蛋白质中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的固有荧光，其会因局部环境的变化而改变，例如温度依赖性的构象变化、寡聚体解离和/或变性。TRPV3 的热变性曲线显示出两个一阶导数峰，分别对应两个熔解温度，第一个熔解温度（Tm1）表现为反向蓝移曲线，在 55.5 ± 0.1°C 处有一个拐点，第二个熔解温度（Tm2）在 63.4 ± 0.3°C 处有一个拐点（图 4c，d）。

图 4 | DPBA 导致 TRPV3 五聚体增加。a，存在 320 μM DPBA 时膜嵌入 TRPV3 的 HS-AFM 视频帧。在许多四聚体中，观察到了 TRPV3 五聚体（白色箭头）和片段（灰色箭头；1，单体；2，二聚体；3，三聚体）。比例尺，15 纳米。b，无（深棕色）和存在 320 μM DPBA（浅棕色）时四聚体和五聚体种群（左）以及四聚体、五聚体和片段种群（右）的统计。

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相较于目前市场上的原子力显微镜成像设备，HS-AFM突破了 “扫描成像速慢”的限制，扫描速度高可达 20 frame/s，并且有 4 种扫描台可供选择。样品无需特殊固定染色，不影响生物分子的活性，尤其适用于生物大分子互作动态观测。液体环境下直接检测，超快速动态成像，分辨率为纳米水平。探针小，适用于生物样品；悬臂探针共振频率高，弹簧系数小，避免了对生物样品等的损伤。悬臂探针可自动漂移校准，适用于长时间观测。采用动态PID控制，高速扫描时仍可获得清晰的图像。XY轴分辨率2nm；Z轴分辨率0.5nm。

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目前已经解析了大量的瞬时受体电位通道TRP(transient receptor potential)家族的结构，显示都是四聚体，但关于TRPV通道的许多方面仍然知之甚少，包括孔膨胀现象（pore-dilation phenomenon）。科学家通过超高速原子力显微镜HS-AFM，在单分子水平上分析了膜嵌入的TRPV3，并发现了一种五聚体状态。并且通过NanoDSF进一步探究了 DPBA对TRPV3四聚体状态的破坏作用。

 

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